镍琼脂糖凝胶FF
镍-琼脂糖凝胶FF（IDA）
（Ni-Berpharose FF-IDA）
1. 产品介绍
镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），之后螯合Ni2+。IDA是金属螯合层析中常用的配体，和次氮基三乙酸（NTA）相比，IDA具有亲和力强、载量高、可再生重复使用等优点。
镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化含有组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。组氨酸标签中的咪唑环同过渡金属Ni2+形成稳定的配位键，能特异、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基质上，可通过增加咪唑浓度对重组蛋白进行竞争洗脱。
2.规格
1ml（预装柱）、5ml（预装柱）、10ml（预装柱）、20ml、100ml、500ml
3.产品性能
性能
指标
基质
6%琼脂糖微球
配基
Ni2+
载量
≥40mg His标签蛋白/ml
粒径
45-165μm
流速
50-300 cm/h
耐压
0.3MPa
工作温度
4-40℃
pH稳定范围:正常/脱镍
5-12/3-14
储存缓冲液
20%乙醇
储存温度
4-8℃
4.纯化流程
①平衡
镍-琼脂糖凝胶FF柱用2-5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。
建议流速为100 cm/h。
②上样
（1）样品一般溶解于pH6-8的初始缓冲液中。提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。
（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时避免巯基乙醇、DTT等还原剂。
（3）常用缓冲液有10-100 mM磷酸钠缓冲液、20-200 mM Tris-HCl缓冲液等。
（4）缓冲液中一般要加入0.15-0.5 M的NaCl以消除离子交换作用。
（5）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，推荐使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4）作为初始缓冲液。
③洗脱
（1）增加咪唑浓度进行洗脱是镍-琼脂糖凝胶FF常用的洗脱方法。
（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。
（3）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从低
到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。
（4）有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。
洗脱方法：
（1）降低pH洗脱：大多数蛋白在pH4-6会被洗脱下来（也可以在pH 3~4），缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。
（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度（如0-0.5M咪唑、0-50 mM组氨酸、0-2M NH4Cl）。梯度洗脱在起始缓冲液的恒定pH值下进行。
（3）螯合剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白，还会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。
注：降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落，下次使用前需要重新螯和金属离子。常用的方法为竞争性洗脱。
上述洗脱方法，均须在缓冲液中加入150 -500mM的NaCl以消除离子交换作用。
5.再生、清洗、保存
①凝胶再生
（1）多次使用后或需要更换螯合的金属离子时，必须将凝胶脱镍再生。脱镍方法：用5-10个柱体积的蒸馏水淋洗柱子，再用5-10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，用2-3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。
（2）多次使用的柱子脱镍后一般需要进行清洗。清洗方法：用0.1-1.0 M NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1-2 h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。
（3）清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法：用2-5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍后的柱子，用0.1-0.3 M金属盐溶液过柱5-10个柱体积以螯合金属离子，之后用5-10个柱体积的蒸馏水淋洗以去除未螯合的金属离子。
②在位清洗
（1）去除因离子交换作用吸附的蛋白：使用1.5M NaCl 溶液接触时间为10-15 分钟清洗，然后，再使用去离子水清洗10 个柱体积。
（2）去除强疏水性蛋白和脂质等：通过使用30%异丙醇清洗5-10 个柱体积，接触时间为15-20 分钟可以去除此类污染物。 然后，再使用10 倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液， 清洗填料2 倍柱体积。例如，含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液，接触时间 为1–2 小时。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5 个柱体积，以彻底去除去污剂。 使用10 倍柱体积的去离子水清洗。
（3）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白：参照凝胶再生步骤。
6.注意事项：
1)使用时保证柱子和缓冲液的温度一致，避免柱床内产生气泡，影响纯化效果。
2)本产品保存条件为20%乙醇，4-8℃。
3) 2-25℃,常压,避光运输
仅供科研实验使用
